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    大鼠(Rat)中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)ELISA 檢測試劑盒

    發布時間: 2009-12-18  點擊次數: 2479次

     

    試驗原理
    NE試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗(ELISA).已知NE濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將NE和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌,去除未結合的酶結合物,然后加入底物A、B,和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中NE的濃度呈比例關系。
     
    試劑盒內容及其配制

    試劑盒成份(2-8℃保存)
    96孔配置
    48孔配置
    配制
    96/48人份酶標板
    1塊板(96T)
    半塊板(48T)
    即用型
    塑料膜板蓋
    1塊
    半塊
    即用型
    標準品:40ng/ml
    1瓶(0.6ml)
    1瓶(0.3ml)
    按說明書進行稀稀
    空白對照
    1瓶(1.0ml)
    1瓶(0.5ml)
    即用型
    標準品稀釋緩沖液
    1瓶(5ml)
    1瓶(2.5ml)
    即用型
    生物素標記的抗NE抗體
    1瓶(6ml)
    1瓶(3.0ml)
    即用型
    親和鏈酶素-HRP
    1瓶(10ml)
    1瓶(5.0ml)
    即用型
    洗滌緩沖液
    1瓶(20ml)
    1瓶(10ml)
    按說明書進行稀釋
    底物A
    1瓶(6.0ml)
    1瓶(3.0ml)
    即用型
    底物B
    1瓶(6.0ml)
    1瓶(3.0ml)
    即用型
    終止液
    1瓶(6.0ml)
    1瓶(3.0ml)
    即用型
    標本稀釋液
    1瓶(12ml)
    1瓶(6.0ml)
    即用型

     
    自備材料
    1. 蒸餾水。
    2. 加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
    3. 振蕩器及磁力攪拌器等。
     
    安全性
    1. 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。
    2. 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
    3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
     
    操作注意事項
    1. 試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄,不可保存。
    2. 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質。
    3. 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
    4. 使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
    5. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
    6. 洗滌酶標板時應充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
    7. 底物A應揮發,避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
    8. 加入試劑的順序應一致,以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
    9. 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
     
    樣品收集、處理及保存方法
    1、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
    2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
    3、 細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
    4、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,取上清液
    5、 保存------如果樣品不立即使用,應將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
     
    試劑的準備
    1. 標準品:標準品的系列稀釋應在實驗時準備,不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行:

    40 ng/ml
    (6號標準品)
    原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
    20 ng/ml
    (5號標準品)
    100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
    10 ng/ml
    (4號標準品)
    100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
    5.0 ng/ml
    (3號標準品)
    100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
    2.5 ng/ml
    (2號標準品)
    100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
    1.25 ng/ml
    (1號標準品)
    100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
    0 ng/ml
    (空白對照)
    原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

     
    2. 洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。
     
    操作步驟
    1. 使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產生加樣上的誤差。
    2. 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定,能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1:1稀釋后加入50ul于反應孔內。
    3. 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時。
    4. 甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。
    5. 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
    6. 甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。
    7. 每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。
    8. 取出酶標板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應立即測定結果。
    9. 在450nm波長處測定各孔的OD值。
     
    建議使用的實驗方案

     
    標準品濃度(ng/ml)
     
    A
    40
    40
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    B
    20
    20
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    C
    10
    10
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    D
    5.0
    5.0
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    E
    2.5
    2.5
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    F
    1.25
    1.25
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    G
    0
    0
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    H
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品

     
     
    局限
    6號標準品以上的結果為非線性的,根據此標準曲線無法得到的結果。
     
    試劑盒性能
    1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
    2. 特異性:不與其它細胞因子反應。
    3. 重復性:板內、板間變異系數均小于10%。
     
    結果 判 斷
    1、儀器值:于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD
     
    2、以吸光度OD值為縱坐標(Y),相應的NE標準品濃度為橫坐標(X),做得相應的曲線,樣品的NE含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。
     
    3檢測值范圍:0-40ng/ml
     
    4、敏感度: 0.1 ng/ml
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